ข้อมูลบริการทดสอบฤทธิ์การต้านการอักเสบ (Anti-Inflammation) โดยการทดสอบ Nitric Oxide assay

บริษัท วิสไบโอ (VISBIO) จำกัด มีบริการรับทดสอบฤทธิ์การต้านการอักเสบ (Anti-Inflammation) โดยการทดสอบ Nitric Oxide assay ได้กับตัวอย่างหลากหลายผลิตภัณฑ์ ซึ่งการทดสอบนี้ เหมาะกับผลิตภัณฑ์ที่เน้นคุณสมบัติเรื่องความสามารถในการต้านการอักเสบ

กระบวนการอักเสบ (Inflammatory Process) เป็นกระบวนการที่ร่างกายตอบสนองต่อสิ่งที่กระทำกับร่างกาย เพื่อปกป้องร่างกาย ถือเป็นส่วนหนึ่งของภูมิคุ้มกันและการฟื้นฟูของร่างกาย เมื่อเกิดการบาดเจ็บหรือการถูกทำลายของเซลล์ กระบวนการนี้จะเกิดขึ้นในหลายขั้นตอน เริ่มต้นจากการกระตุ้นที่เกิดขึ้นเมื่อมีการบาดเจ็บหรือการทำลายเซลล์ในร่างกาย เช่น การบาดเจ็บ, การติดเชื้อ เป็นต้น เมื่อเกิดการกระตุ้นเซลล์เม็ดเลือดขาวจะถูกปลดปล่อยออกมาในพื้นที่ที่เกิดการอักเสบ หลอดเลือดจะขยายตัวเพื่อเพิ่มการไหลเวียนของเลือดไปยังพื้นที่นั้น สิ่งนี้ช่วยให้สารสกัดและเซลล์ภูมิคุ้มกันเข้าสู่พื้นที่นั้นได้ง่ายขึ้น ดังนั้นผลิตภัณฑ์ที่มีคุณสมบัติต้านการอักเสบ ก็จะเข้าไปทำหน้าที่ในการต่อสู้กับสิ่งที่ก่อให้เกิดการอักเสบในร่างกาย หลังจากนั้นร่างกายจะเริ่มกระบวนการฟื้นฟูและกระบวนการอักเสบจะหยุดลง

การทดสอบฤทธิ์การต้านการอักเสบ ในเซลล์แมคโครฟาจ (RAW254.7) โดยวิเคราะห์ผลปริมาณของไนตริกออกไซด์ (NO) ภายใต้สภาวะการทดสอบเซลล์ 2 มิติ (2D Cell) เหมาะกับวัตถุดิบ หรือ สมุนไพร หรือ สารสกัด หรือ ผลิตภัณฑ์เครื่องสำอาง หรือ ผลิตภัณฑ์เสริมอาหาร หรือ ผลิตภัณฑ์ยา ที่มีคุณสมบัติช่วยต้านการอักเสบ

การอักเสบ (inflammation)

การอักเสบ (inflammation) เป็นปฏิกิริยาอันซับซ้อนที่เนื้อเยื่อต่างๆ ตอบสนองต่อเชื้อจุลชีพ และสิ่งที่เป็นอันตรายต่อร่างกาย ก่อให้เกิดการเปลี่ยนแปลงทางชีวเคมีในร่างกาย ทำให้เกิดการหลั่งของสารสื่อกลางในการอักเสบ (inflammatory mediators) ชนิดต่างๆ รวมทั้ง ไนตริกออกไซด์ (nitric oxide) และ Prostaglandins E2 ออกจากเซลล์เม็ดเลือดขาวและเซลล์แมคโครฟาจ ทั้งไนตริกออกไซด์ และ Prostaglandins E2 มีฤทธิ์ส่งเสริมการอักเสบ ในปัจจุบันมีรายงานว่าการอักเสบเป็นสาเหตุที่ทำให้เกิดโรคต่างๆ เช่น โรคมะเร็ง โรคไขข้อเสื่อม โรคหลอดเลือดแดงแข็งตัว ภาวะช็อคจากการติดเชื้ออย่างรุนแรง(Septic shock) การปฏิเสธของเนื้อเยื่อในการปลูกถ่ายอวัยวะ โรคสมองเสื่อม เช่น โรคอัลไซเมอร์(Alzheimer’s disease) โรคพาร์กินสัน (Parkinson’s disease) โรคเบาหวาน โรคกระเพาะและลำไส้อักเสบ เป็นต้น

กระบวนการของการอักเสบในร่างกาย (Inflammatory Process)

กระบวนการอักเสบ (Inflammatory Process) เป็นกระบวนการที่ร่างกายตอบสนองต่อสิ่งที่กระทำกับร่างกาย เพื่อปกป้องร่างกาย เป็นส่วนหนึ่งของภูมิคุ้มกันของร่างกาย ขั้นแรกเป็นระบบภูมิคุ้มกันแบบไม่จำเพาะเจาะจงเป็นการตอบสนองการอักเสบเฉียบพลัน (Acute Inflammation) คือ การขยายตัวของหลอดเลือดเพื่อให้เลือดมาหล่อเลี้ยงมากขึ้น เพื่อให้นิวโทรฟิล และแมคโครฟาจออกนอกหลอดเลือด เซลล์เม็ดเลือดขาวกลืนกลิ่นสิ่งแปลกปลอม (Phagocytosis) และหลั่งสาร Pro-inflammatory mediators และ Pro-inflammatory cytokines แต่เมื่อมีการทำลายสิ่งแปลกปลอม อย่างต่อเนื่อง เรียกว่าภาวการณ์อักเสบเรื้อรัง (Chronic Inflammatory) ที่อาจก่อให้เกิดโรคต่างๆ เช่น โรคมะเร็ง โรคไขข้อเสื่อม โรคเบาหวาน โรคหลอดเลือดแข็งตัว และโรคเสื่อมของระบบประสาท ในการอักเสบจะมีการหลังสารสื่อกลางในการอักเสบ เช่น Prostaglandin E2 (PGE2), Histamine, 5-Hydroxytryptamine (5-HT), Kinin, Nitric oxide, Cytokines, Leukotrienes and Hydroxy Arachidonic acid, Platelet-Activativating Factor (PAF), Complements และ Hydrolytic enzymes

กระบวนการอักเสบ สามารถแบ่งออกได้เป็น 2 ประเภท คือ การอักเสบเฉียบพลัน (acute inflammation) และการอักเสบแบบเรื้อรัง (chronic inflammation) โดยการอักเสบแบบเฉียบพลันนั้น จะมีระยะการเกิดที่รวดเร็วมากอาจจะเป็นวินาทีหรือนาทีหลังจากที่ได้รับสิ่งกระตุ้น และจะคงอยู่ประมาณ 2 ถึง 3 วัน อาการหลักๆ ของการอักเสบเฉียบพลัน คือ เกิดการบวมของเนื้อเยื่อ (edema) มีสารน้ำที่มีโปรตีนอยู่ภายในเนื้อเยื่อ (exudate) และยังพบเซลล์อักเสบชนิดนิวโทรฟิลล์ในปริมาณมาก รองลงมา คือ เซลล์แมคโครฟาจ ส่วนการอักเสบแบบเรื้อรัง มีระยะเวลาการเกิดที่นานกว่า โดยอาการของการอักเสบเรื้อรังนั้น คือ เกิดการสร้างเนื้อเยื่อพังผืด (fibrosis) และเซลล์อักเสบหลักที่พบ คือ เซลล์แมคโครฟาจและลิมโฟไซต์(lymphocytes)

สาร Nitric oxide (NO) จัดเป็นอนุมูลอิสระชนิดหนึ่งที่มีคุณสมบัติเป็นสารสื่อกลางการอักเสบ NO สังเคราะห์ ขึ้นจาก L-arginine และ โมเลกุลของออกซิเจนโดยการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์ nitric oxide synthase (NOS) โดย NO ที่สร้างขึ้นจากกระบวนการ ดังกล่าวมีความสัมพันธ์กับการเกิดพยาธิสภาพของการอักเสบ เช่น การขยายตัวของหลอดเลือดเมื่อเกิดการบาดเจ็บ ภาวะหัวใจขาดเลือด เกิดการอักเสบแบบฉับพลัน และเรื้อรัง โดย NO ที่เพิ่มมากกว่าปกติจะทำปฏิกริยากับ superoxide anion radical (O2•-) เกิดเป็น peroxynitrite (ONOO-) ที่มีฤทธิ์รุนแรงฆ่าจุลชีพได้และยังสามารถทำลายเซลล์เนื้อเยื่อบริเวณที่เกิดการบาดเจ็บทำให้เกิดการอักเสบเพิ่มมากขึ้น ดังนั้นการยับยั้ง NO เป็นวิธีการหนึ่งที่นิยมใช้ในการศึกษาฤทธิ์ต้านการอักเสบ

สาเหตุของการเกิดการอักเสบ

การอักเสบ เกิดจาก 2 สาเหตุ ดังนี้

สาเหตุจากภายนอกร่างกาย (exogenous)

  • Mechanical injury คือ การบาดเจ็บมาจากแรงธรรมชาติประเภทต่างๆ ที่กระทำต่อเนื้อเยื่อให้บาดเจ็บโดยตรง เช่น การผ่าตัด, แทง, ตี, ยิง, ชน เป็นต้น
  • Thermal injury คือ การบาดเจ็บมาจากอันตรายของความร้อน เช่น น้ำร้อน, ไฟไหม้, น้ำมันลวก เป็นต้น
  • Electrical injury คือ การบาดเจ็บมาจากอันตรายของกระแสไฟฟ้า เช่น ฟ้าผ่า, ไฟฟ้า
    ลัดวงจร, ไฟดูด เป็นต้น
  • Radiation injury คือ การบาดเจ็บมาจากอันตรายจาการแผ่รังสีและสารกัมมันตภาพรังสี เช่น ultraviolet rays, X rays, radium เป็นต้น
  • Chemical injury คือ การบาดเจ็บจากสารเคมีภายนอกร่างกาย เช่น กรดหรือด่างอย่างแรงสารเหล่านี้ทำอันตรายให้เนื้อเยื่อบาดเจ็บได้มาก
  • Microbiologic injury การบาดเจ็บจากการกระทำของสิ่งมีชีวิตขนาดเล็ก เช่น ไวรัส,
    แบคทีเรีย, โปรโตซัว, พยาธิ เป็นต้น

สาเหตุจากภายในร่างกาย (endogenous)

  • การบาดเจ็บจากสารเคมีภายในร่างกาย เช่น น้ำดี (bile), น้ำย่อยจากตับอ่อน (pancreatic
    juice), น้ำย่อยจากกระเพาะอาหาร (gastric juice) และปัสสาวะ (urine) สารเหล่านี้หากเข้าไปในช่องท้องหรืออวัยวะอื่นๆ อาจทำให้เนื้อเยื่อบาดเจ็บได้
  • Immune mechanism injury คือ การบาดเจ็บจากปฏิกิริยาภูมิคุ้มกัน เช่น โรคภูมิคุ้มกันไว
    เกิน (hypersensitivity)
  • สาเหตุอื่นๆ เช่น การขาดเลือดไปเลี้ยง (ischemia) ทำให้เกิด myocardial infarction หรือ
    การลอกตัวของผนังมดลูกระหว่างมีระดู (menstruation) เป็นต้น

กลุ่มสารที่ออกฤทธิ์ยับยั้งกระบวนการอักเสบ

สารองค์ประกอบทางเคมี (Chemical Compound) ที่ออกฤทธิ์ช่วยกระบวนการการยับยั้งการอักเสบ จัดประเภทได้ดังนี้

  1. สารองค์ประกอบ แอลคาลอยด์ (Alkaloids) โดยสารแอลคาลอยด์สามารถแยกประเภทออกเป็น Isoquinoline alkaloids, Steroid alkaloids, Purine alkaloid, Lactam alkaloid, Amide alkaloids, Indole alkaloids ยกตัวอย่างสมุนไพรที่มีองค์ประกอบของสารแอลคาลอยด์ ได้แก่ ดอกลิลลี่แมงมุมสีแดง (Lycoris radiata; L’Her.) ผักเบี้ยใหญ่ (Portulaca oleracea L.) ชวนป๋วย (Bulbus Fritillariae cirrhosae) พริกไทย (Piper nigrum L.) งาขี้ม้อน (Perilla frutescens (L.) Britt) พลูคาว (Houttuynia cordata Thunb) เป็นต้น
  2. สารองค์ประกอบ เทอร์พีนอยด์ (Terpenoid) โดยสารเทอร์พีนอยด์สามารถแยกประเภทออกเป็น Monoterpenoid, Sesquiterpenes, Triterpenoids ยกตัวอย่างสมุนไพรที่มีองค์ประกอบของสารเทอร์พีนอยด์ ได้แก่ งาขี้ม้อน (Perilla frutescens (L.) เห็ดหลินจือ (Ganoderma lucidum) กว่างฮั่วเซียง (Pogostemonis herba) ฝูหลิง (Poria cocos) เป็นต้น
  3. สารองค์ประกอบ พอลิแซ็กคาไรด์ (Polysaccharide) ยกตัวอย่างสมุนไพรที่มีองค์ประกอบพอลิแซ็กคาไรด์ ได้แก่ เห็ดหลินจือ (Ganoderma lucidum), ฝูหลิง (Poria cocos) พลูคาว (Houttuynia cordata Thunb) แป๊ะฮะ (Lilium lancifolium Thunb) แปะก๊วย (Ginkgo biloba) ต้าเจ่า (Ziziphus jujuba Mill.)  เป็นต้น
  4. สารองค์ประกอบ ฟีนอลิค (Phenolic) ยกตัวอย่างสมุนไพรที่มีองค์ประกอบฟีนอลิค ได้แก่ ชะเอมเทศ (Glycyrrhiza uralansis Fisch), ปักคี้ (Radix astragali), อึ่งคี้ (Astragalus mongholicus Bunge) ส้มซ่า (Citrus aurantium L. var. Amara Engl.) พลูคาว (Houttuynia cordata Thunb) มะขามป้อม (Phyllanthus emblica) แปะก๊วย (Ginkgo biloba) ต้าเจ่า (Ziziphus jujuba Mill.) ซันจูยู้ (Corni fructus) เป็นต้น
  5. สารองค์ประกอบ คูมาริน (Coumarin) ยกตัวอย่างสมุนไพรที่มีองค์ประกอบคูมาริน ได้แก่ แปะจี้ (Angelica dahurica), ส้มซ่า (Citrus aurantium L. var. Amara Engl.) เป็นต้น
  6. Essential oil เช่น น้ำมันหอมระเหยในโกฐสอ (Angelicae dahuricae Radix), ส้มซ่า (Citrus aurantium L. var. Amara Engl.), ส้มโอมือ (Citrus medica L. var. Sarcodactylis) เป็นต้น
  7. Volatile oil เช่น น้ำมันในโกฐสอ (Angelicae dahuricae Radix) เป็นต้น
  8. Ginsenosides เช่น โสมเกาหลี (Panax ginseng) โสมดำ (Black ginseng) เป็นต้น

วิธีการทดสอบฤทธิ์การต้านการอักเสบ (Nitric Oxide Assay)

การทดสอบฤทธิ์การต้านการอักเสบ (Anti-inflammatory activity) ในเซลล์แมคโครฟาจ (RAW254.7) โดยวิเคราะห์ผลจากการปริมาณของไนตริกออกไซด์ (NO) หรือการทดสอบความสามารถในการการยับยั้งการหลั่งสาร Nitric oxide ภายใต้สภาวะการทดสอบเซลล์ 2 มิติ (2D Cell) โดยเลี้ยงเซลล์ ใน 96-well microplates วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 570 nm ด้วยเครื่อง Microplate reader จากนั้นคำนวณ % inhibition of NO production และสามารถพล็อตกราฟเพื่อหาค่าความเข้มข้นที่สามารถการยับยั้งสารไนตริกออกไซด์ ในรูปแบบค่า IC50 (Inhibitory concentration at 50%)

ตัวอย่างการรายงานผลการวิเคราะห์ฤทธิ์การยับยั้งการอักเสบ

การทดสอบความสามารถในการยับยั้งการอักเสบของสาร 4-methoxycinnamyl 4-coumarate ที่แยกได้จากเหง้าเร่วหอม  โดยทำการบ่มเซลล์แมคโครฟาจ RAW 264.7 ด้วย LPS และสารตัวอย่างที่ความเข้มข้น 0.7-37.5 μM และวิเคราะห์ปริมาณไนไตรท์ในอาหารเลี้ยงเซลล์ พบว่าสารตัวอย่างสามารถยับยั้งการผลิตสารไนตริกออกไซด์ จากภาพพบว่ามีค่า IC50 เท่ากับ 14.2±2.3 μM โดยมีสารควบคุมแบบบวก 2 สาร คือ Aminoguanidine (AG) ที่เป็นสาร iNOS inhibitor

Literature:

  • กล่าวขวัญ ศรีสุข และ เอก รัฐ ศรีสุข. “การ ประเมิน ศักยภาพ ของ 4-methoxycinnamyl 4-coumarate ที่ แยก ได้ จาก เหง้า เร่ว หอม ใน การ เป้ น สาร ต้าน อักเสบ ชนิด ใหม่.”
  • Lu, Qiuxia, et al. “Ingredients with anti-inflammatory effect from medicine food homology plants.” Food Chemistry 368 (2022): 130610.
  • จเร จรัสจรูญพงศ์, ประภาพรรณ เตชะเสาวภาคย์ และ กล่าวขวัญ ศรีสุข, 2557, รายงานการวิจัยฉบับสมบรูณ์การสังเคราะห์และฤทธิ์ต้านการอักเสบของสารไตรเอริลมีเทนแบบไม่สมมาตร, มหาวิทยาลัยบูรพา.
  • อนันต์ อธิพรชัย, สุวรรณา เสมศรี และ สุรีย์พร หอมวิเศษวงศา, 2562, คุณสมบัติต้านการอักเสบและความเป็นพิษของสารสกัดสมุนไพร ในกลุ่มที่รักษาเบาหวาน,  มหาวิทยาลัยบูรพา.