HPLC คืออะไร? หลักการทำงาน และการวิเคราะห์สารสำคัญ (Bio Marker Analysis)

เมื่อแบรนด์บอกว่าสารสกัดมีเคอร์คูมินอยด์กี่เปอร์เซ็นต์ หรือผลิตภัณฑ์เสริมอาหารระบุปริมาณสารสำคัญไว้บนฉลาก ต้องมีการวัดค่านั้นจริง และในห้องปฏิบัติการส่วนใหญ่ ค่านั้นวัดด้วย HPLC บทความนี้อธิบายว่า HPLC คืออะไร หลักการทำงานเป็นอย่างไร เครื่องประกอบด้วยอะไรบ้าง อ่านผลอย่างไร และใช้วิเคราะห์สารสำคัญในวัตถุดิบ สารสกัด และผลิตภัณฑ์สำเร็จรูปได้อย่างไร

HPLC คืออะไร? ย่อมาจากอะไร

HPLC ย่อมาจาก High-Performance Liquid Chromatography หรือ “โครมาโทกราฟีของเหลวสมรรถนะสูง” (บางครั้งเรียกว่า High-Pressure Liquid Chromatography) คือเทคนิคการวิเคราะห์ที่ใช้แยกสารแต่ละชนิดในตัวอย่างที่เป็นของเหลว ระบุว่าเป็นสารอะไร และวัดปริมาณของสารแต่ละตัว โดยใช้ปั๊มแรงดันสูงดันตัวอย่างที่ละลายอยู่ในของเหลวที่เรียกว่าเฟสเคลื่อนที่ (Mobile Phase) ผ่านคอลัมน์ที่บรรจุอนุภาคขนาดเล็กซึ่งทำหน้าที่เป็นเฟสคงที่ (Stationary Phase) สารแต่ละชนิดเคลื่อนที่ผ่านคอลัมน์ด้วยความเร็วต่างกัน จึงออกจากคอลัมน์ต่างเวลากันและถูกตรวจวัดได้ทีละตัว

HPLC ใช้ได้ทั้งการวิเคราะห์เชิงคุณภาพ (มีสารอะไรอยู่บ้าง) และเชิงปริมาณ (มีอยู่เท่าไร) ใช้ตัวอย่างเพียงเล็กน้อย และให้ผลที่ทำซ้ำได้ จึงเป็นเทคนิคที่นิยมใช้อย่างแพร่หลายในห้องปฏิบัติการด้านยา อาหาร เครื่องสำอาง และผลิตภัณฑ์สมุนไพร

โครมาโทกราฟี คืออะไร

HPLC เป็นหนึ่งในเทคนิคกลุ่ม “โครมาโทกราฟี” (Chromatography) ซึ่งแยกสารผสมด้วยหลักเดียวกัน คือให้สารผสมเคลื่อนที่ไปพร้อมเฟสเคลื่อนที่ผ่านเฟสคงที่ สารแต่ละชนิดเกิดอันตรกิริยากับเฟสคงที่มากน้อยต่างกัน จึงเคลื่อนที่ได้ช้าเร็วไม่เท่ากันและแยกออกจากกัน

โครมาโทกราฟีกระดาษ (Paper Chromatography) และโครมาโทกราฟีแบบแผ่นบาง (TLC) ใช้กระดาษหรือแผ่นเคลือบเป็นเฟสคงที่ แก๊สโครมาโทกราฟี (GC) ใช้แก๊สเป็นเฟสเคลื่อนที่ ส่วน HPLC ใช้ของเหลวภายใต้แรงดันสูงร่วมกับคอลัมน์ที่บรรจุอนุภาคละเอียด ทำให้แยกสารได้เร็วและแม่นยำกว่าการแยกด้วยคอลัมน์แบบดั้งเดิมมาก

หลักการทำงานของ HPLC

หลักการ HPLC คือการแยกสารในตัวอย่างของเหลวด้วยสองเฟส ได้แก่ เฟสคงที่ (Stationary Phase) และเฟสเคลื่อนที่ (Mobile Phase) โดยเครื่อง HPLC ทำงานเป็นขั้นตอนดังนี้:

1. ปั๊มส่งเฟสเคลื่อนที่: ปั๊มแรงดันสูงดันตัวทำละลายซึ่งเป็นเฟสเคลื่อนที่ให้ไหลผ่านระบบด้วยอัตราการไหลคงที่
2. ฉีดตัวอย่าง: ตัวอย่างที่เตรียมไว้ถูกฉีดเข้าสู่กระแสของเฟสเคลื่อนที่ผ่านเครื่องฉีดตัวอย่างอัตโนมัติ (Autosampler)
3. แยกสารในคอลัมน์: ตัวอย่างถูกพาเข้าคอลัมน์ที่บรรจุเฟสคงที่ สารที่เกิดอันตรกิริยากับเฟสเคลื่อนที่มากกว่าจะออกจากคอลัมน์ก่อน ส่วนสารที่เกิดอันตรกิริยากับเฟสคงที่มากกว่าจะออกทีหลัง
4. ตรวจวัด: สารที่แยกแล้วไหลผ่านเครื่องตรวจวัด (Detector) ซึ่งบันทึกสัญญาณของสารแต่ละตัวเป็นพีค (Peak)
5. ประมวลผล: ซอฟต์แวร์แสดงผลเป็นกราฟที่เรียกว่าโครมาโทแกรม (Chromatogram) ใช้ระบุชนิดของสารและคำนวณปริมาณ

เวลาที่สารใช้เดินทางตั้งแต่ถูกฉีดจนถึงเครื่องตรวจวัดเรียกว่า Retention Time ภายใต้สภาวะการวิเคราะห์เดียวกัน สารชนิดหนึ่งจะมี Retention Time เท่าเดิมเสมอ จึงใช้ค่านี้ระบุชนิดของสารได้

ส่วนประกอบของเครื่อง HPLC

เครื่อง HPLC หนึ่งระบบประกอบด้วยส่วนหลัก ๆ ดังนี้:

• ขวดเก็บตัวทำละลาย (Solvent Reservoir): บรรจุเฟสเคลื่อนที่ มักต่อกับเครื่องไล่ฟองอากาศ (Degasser)
• ปั๊ม (Pump): ส่งเฟสเคลื่อนที่ด้วยแรงดันสูงและอัตราการไหลคงที่
• เครื่องฉีดตัวอย่าง (Injector/Autosampler): ฉีดตัวอย่างในปริมาตรที่แม่นยำ และทำงานต่อเนื่องได้ทีละหลายตัวอย่าง
• คอลัมน์ (Column) และตู้ควบคุมอุณหภูมิคอลัมน์: หัวใจของการแยกสาร คอลัมน์ที่ใช้มากที่สุดคือคอลัมน์ C18
• เครื่องตรวจวัด (Detector): เปลี่ยนสารที่แยกออกมาให้เป็นสัญญาณ
• ระบบประมวลผลข้อมูล (Data System): ซอฟต์แวร์ควบคุมเครื่อง บันทึกโครมาโทแกรม และคำนวณผล

Mobile Phase และ Stationary Phase คืออะไร

Mobile Phase (เฟสเคลื่อนที่) คือของเหลวที่พาตัวอย่างเคลื่อนที่ผ่านระบบ โดยทั่วไปเป็นส่วนผสมของน้ำ (มักเติมบัฟเฟอร์หรือกรด) กับตัวทำละลายอินทรีย์อย่างเมทานอลหรืออะซีโตไนไทรล์ อาจใช้สัดส่วนคงที่ตลอดการวิเคราะห์ (Isocratic) หรือค่อย ๆ เปลี่ยนสัดส่วน (Gradient) เพื่อแยกสารที่มีสมบัติแตกต่างกันมาก

Stationary Phase (เฟสคงที่) คือวัสดุที่บรรจุอยู่ในคอลัมน์ ที่พบบ่อยที่สุดคือซิลิกาที่ยึดสายโซ่คาร์บอน 18 อะตอม หรือที่เรียกว่า คอลัมน์ C18 ซึ่งใช้ในโหมด Reversed Phase

Reversed Phase กับ Normal Phase ต่างกันอย่างไร

ใน Reversed Phase HPLC ซึ่งเป็นโหมดที่ใช้มากที่สุด เฟสคงที่มีขั้วต่ำ (เช่น C18) และเฟสเคลื่อนที่มีขั้วสูง สารที่มีขั้วสูงจะออกจากคอลัมน์ก่อน ส่วนสารที่มีขั้วต่ำจะถูกหน่วงไว้นานกว่า Normal Phase HPLC ทำงานกลับกัน คือใช้เฟสคงที่ที่มีขั้วร่วมกับเฟสเคลื่อนที่ที่มีขั้วต่ำกว่า งานวิเคราะห์สารจากพืช วิตามิน และแคนนาบินอยด์ส่วนใหญ่ใช้คอลัมน์แบบ Reversed Phase

Detector ของ HPLC มีอะไรบ้าง

เครื่องตรวจวัดทำหน้าที่เปลี่ยนสารที่แยกออกมาให้เป็นสัญญาณ การเลือกใช้ขึ้นกับสารที่ต้องการวัด:

• UV-Vis และ DAD/PDA: วัดการดูดกลืนแสงของสารที่ความยาวคลื่นที่กำหนด HPLC-DAD บันทึกสเปกตรัมได้ทั้งช่วง ช่วยยืนยันชนิดของสาร เหมาะกับสารที่ดูดกลืนแสง UV หรือแสงที่ตามองเห็น เช่น เคอร์คูมินอยด์ ฟลาโวนอยด์ และวิตามินหลายชนิด
• Fluorescence (FLD): ไวสูงสำหรับสารที่เรืองแสงได้ หรือสารที่ทำให้เรืองแสงได้
• Refractive Index (RI) และ ELSD: ใช้กับสารที่ดูดกลืนแสง UV ได้น้อยหรือไม่ได้เลย เช่น น้ำตาลบางชนิด
• Mass Spectrometry (HPLC-MS หรือ LC-MS): ระบุสารจากมวลโมเลกุล ใช้เมื่อต้องการความจำเพาะหรือความไวสูงมาก

โครมาโทแกรมคืออะไร อ่านผล HPLC อย่างไร

ผลจากการวิเคราะห์ด้วย HPLC คือโครมาโทแกรม (Chromatogram) หรือกราฟแสดงสัญญาณจากเครื่องตรวจวัดเทียบกับเวลา แต่ละพีคคือสาร (หรือกลุ่มสาร) ที่ออกจากคอลัมน์:

• Retention Time (ตำแหน่งของพีคบนแกนเวลา) ใช้ระบุชนิดของสาร โดยเทียบกับสารมาตรฐานอ้างอิง (Reference Standard) ที่วิเคราะห์ภายใต้สภาวะเดียวกัน
• พื้นที่ใต้พีค (Peak Area) แปรผันตามปริมาณสาร จึงใช้ในการคำนวณปริมาณ
• กราฟมาตรฐาน (Standard Calibration Curve): ห้องปฏิบัติการวิเคราะห์สารมาตรฐานที่ความเข้มข้นต่าง ๆ แล้วสร้างกราฟระหว่างพื้นที่ใต้พีคกับความเข้มข้น เพื่อใช้คำนวณปริมาณสารในตัวอย่าง
• การแยกพีค (Resolution): พีคที่แยกจากกันชัดเจนทำให้วัดได้น่าเชื่อถือ ถ้าพีคซ้อนกันต้องปรับวิธีวิเคราะห์

ก่อนวิเคราะห์ตัวอย่างจริง ห้องปฏิบัติการมักทดสอบความเหมาะสมของระบบ (System Suitability) เพื่อยืนยันว่าเครื่องและคอลัมน์ทำงานได้ตามเกณฑ์ในวันนั้น

HPLC กับ UHPLC และ GC ต่างกันอย่างไร

UHPLC คือ HPLC รุ่นที่ใช้อนุภาคขนาดเล็กลงและแรงดันสูงขึ้น ส่วน GC (Gas Chromatography) คือแก๊สโครมาโทกราฟี เหมาะกับสารที่ระเหยได้ ตัวอย่างเช่น Visbio ใช้เทคนิค GC ในการตรวจกลุ่มสารเทอร์ปีนในกัญชา และใช้ HPLC ตรวจสารอย่างเคอร์คูมินอยด์ แอนโดรกราโฟไลด์ และไมทราไจนีน

Bio Marker Analysis คืออะไร และทำไมใช้ HPLC

Bio Marker Analysis หรือการวิเคราะห์สารสำคัญ คือการระบุและวัดปริมาณสารสำคัญในตัวอย่าง ได้แก่ สารที่เกี่ยวข้องกับฤทธิ์ทางชีวภาพ (สารออกฤทธิ์ หรือ Bioactive Compounds) หรือสารที่ใช้เป็นตัวบ่งชี้คุณภาพ ตรวจได้จากตัวอย่างหลายรูปแบบ ได้แก่ พืช ผัก ผลไม้ สมุนไพร สารสกัด ผลิตภัณฑ์เสริมอาหาร ผลิตภัณฑ์สมุนไพร และเครื่องสำอาง ผลการวิเคราะห์บอกได้ว่ามีสารอะไรอยู่และมีปริมาณเท่าไร

ในงานควบคุมคุณภาพระดับสากล สารที่ใช้ตรวจวัดในวัตถุดิบและผลิตภัณฑ์สมุนไพรมักเรียกว่า Marker Compound ขณะที่คำว่า Biomarker ในภาษาอังกฤษมักหมายถึงตัวบ่งชี้ที่วัดจากตัวอย่างทางชีวภาพ เช่น เลือด ปัสสาวะ และน้ำนม ซึ่งบ่งบอกถึงการรับสารเคมีจากภายนอกเข้าสู่ร่างกายได้ด้วย

HPLC เป็นเทคนิคที่นิยมที่สุดสำหรับงานนี้ เพราะแยกสารที่มีโครงสร้างใกล้เคียงกันออกจากกันได้ และวัดปริมาณได้แม่นยำเมื่อเทียบกับสารมาตรฐาน

HPLC วิเคราะห์อะไรได้บ้าง

HPLC ถูกใช้ทุกครั้งที่คุณภาพของสินค้าขึ้นกับการรู้ว่ามีสารอะไรอยู่และมีปริมาณเท่าไร เช่น:

• ตรวจปริมาณสารสำคัญในสารสกัดสมุนไพร เช่น เคอร์คูมินอยด์ในขมิ้นชัน แอนโดรกราโฟไลด์ในฟ้าทะลายโจร และ ไมทราไจนีนในกระท่อม
• ตรวจวิตามินและสารสำคัญในผลิตภัณฑ์เสริมอาหาร เช่น วิตามินซี และ วิตามินบี12
• ตรวจแคนนาบินอยด์ เช่น CBD และสารที่เกี่ยวข้อง ในผลิตภัณฑ์กัญชาและกัญชง
• ตรวจยืนยันสารสำคัญในผลิตภัณฑ์เครื่องสำอาง
• สนับสนุนงานควบคุมคุณภาพ และเป็นฐานของ Test Report ที่ใช้ประกอบใบ COA
• การศึกษาความคงตัว (Stability Study) ที่ติดตามปริมาณสารสำคัญเมื่อเวลาผ่านไป

นอกจากงานวิเคราะห์ ยังมี Preparative HPLC ซึ่งเป็น HPLC ขนาดใหญ่ ใช้แยกและทำให้สารบริสุทธิ์ เช่น เตรียมสารที่ต้องการ หรือกำจัดสารปนเปื้อนออกจากสารที่สนใจ

อะไรทำให้ผล HPLC น่าเชื่อถือ

ผล HPLC น่าเชื่อถือเท่ากับวิธีวิเคราะห์ที่อยู่เบื้องหลัง ห้องปฏิบัติการต้องพัฒนาวิธีสำหรับสารแต่ละตัวและตัวอย่างแต่ละประเภท แล้วตรวจสอบความถูกต้องของวิธี (Method Validation) ซึ่งนิยมอ้างอิงแนวทางสากลอย่าง ICH Q2 โดยพิจารณาค่าต่าง ๆ เช่น:

• Specificity (ความจำเพาะ): วัดสารเป้าหมายได้โดยไม่ถูกสารอื่นรบกวน
• Linearity (ความเป็นเส้นตรง): สัญญาณเพิ่มตามความเข้มข้นอย่างเป็นสัดส่วนในช่วงที่ใช้งาน
• Accuracy (ความแม่น): ค่าที่วัดได้ใกล้เคียงค่าจริง
• Precision (ความเที่ยง): วัดซ้ำแล้วได้ผลใกล้เคียงกัน
• LOD และ LOQ: ปริมาณต่ำสุดที่ตรวจพบได้ และปริมาณต่ำสุดที่วัดเป็นตัวเลขได้อย่างน่าเชื่อถือ

สารมาตรฐาน (Reference Standard) ที่ทราบความบริสุทธิ์เป็นสิ่งจำเป็น หากไม่มีสารมาตรฐานที่ถูกต้อง จะระบุหรือวัดปริมาณสารได้ไม่มั่นใจ นี่คือเหตุผลที่ห้องปฏิบัติการขอข้อมูลของผลิตภัณฑ์ก่อนทดสอบ อ่านต่อที่ เจาะลึกกระบวนการสร้างเอกสาร COA มาตรฐานโลก

ข้อดีและข้อจำกัดของ HPLC

ข้อดีของ HPLC

• แยกสารที่มีโครงสร้างคล้ายกันออกจากกันได้ดี
• วัดปริมาณได้แม่นยำและทำซ้ำได้
• ใช้ตัวอย่างเพียงเล็กน้อย
• วิเคราะห์สารได้หลากหลายชนิด ตั้งแต่สารจากพืชไปจนถึงวิตามิน
• ทำงานอัตโนมัติได้ทีละหลายตัวอย่าง

ข้อจำกัดของ HPLC

• ต้องมีสารมาตรฐานที่เหมาะสมสำหรับสารแต่ละตัว
• การเตรียมตัวอย่างอาจซับซ้อน ขึ้นกับชนิดของตัวอย่าง เช่น ครีม กัมมี่ หรือน้ำมัน
• ไม่เหมาะกับสารที่ระเหยง่าย ซึ่งใช้ GC แทน
• สารที่ไม่ดูดกลืนแสง UV ต้องใช้เครื่องตรวจวัดชนิดอื่น

ส่งตรวจด้วย HPLC ต้องเตรียมอะไร

• ตัวอย่างผลิตภัณฑ์หรือวัตถุดิบในรูปแบบจริง
• ชื่อสารที่ต้องการวัด และปริมาณที่คาดไว้ (ถ้ามี)
• เอกสารส่วนประกอบ เช่น COI, COA ของผู้จำหน่าย หรือ Spec
• ลักษณะของตัวอย่าง เช่น ครีม แคปซูล ผง หรือเครื่องดื่ม
• วัตถุประสงค์ของการตรวจ เช่น ยืนยันค่าบนฉลาก ตรวจสอบผู้จำหน่าย หรือศึกษาความคงตัว

ค่าบริการตรวจ HPLC ขึ้นอยู่กับจำนวนสารที่ต้องการวัด การมีวิธีวิเคราะห์ที่พร้อมใช้สำหรับตัวอย่างประเภทนั้น ความพร้อมและราคาของสารมาตรฐาน และจำนวนตัวอย่าง ส่งรายละเอียดให้ทีมประเมินก่อนได้

คำถามที่พบบ่อยเกี่ยวกับ HPLC

HPLC คืออะไร?

HPLC คือโครมาโทกราฟีของเหลวสมรรถนะสูง (High-Performance Liquid Chromatography) เทคนิคที่ใช้แยก ระบุ และวัดปริมาณสารในตัวอย่างของเหลว

หลักการของ HPLC คืออะไร?

สารแต่ละชนิดเกิดอันตรกิริยากับเฟสคงที่และเฟสเคลื่อนที่ไม่เท่ากัน จึงเคลื่อนที่ผ่านคอลัมน์ด้วยความเร็วต่างกันและแยกออกจากกัน

HPLC กับ GC ต่างกันอย่างไร?

HPLC ใช้ของเหลวเป็นเฟสเคลื่อนที่ เหมาะกับสารที่ไม่ระเหย ส่วน GC ใช้แก๊ส เหมาะกับสารที่ระเหยได้

โครมาโทแกรมคืออะไร?

กราฟผลจากการวิเคราะห์ที่แสดงสัญญาณของสารแต่ละตัวเป็นพีคเทียบกับเวลา ใช้ระบุชนิดและคำนวณปริมาณสาร

คอลัมน์ C18 คืออะไร?

คอลัมน์ที่บรรจุซิลิกาซึ่งยึดสายโซ่คาร์บอน 18 อะตอม เป็นเฟสคงที่ที่ใช้มากที่สุดใน Reversed Phase HPLC

ทำไม HPLC ต้องใช้สารมาตรฐาน?

เพื่อยืนยันชนิดของสารจาก Retention Time และสร้างกราฟมาตรฐานสำหรับคำนวณปริมาณ

บทความที่เกี่ยวข้อง

• COA คืออะไร? เอกสาร Certificate of Analysis ใครออก และอ่านอย่างไร
• เจาะลึกกระบวนการสร้างเอกสาร COA มาตรฐานโลก
• คู่หูเอกสาร COI – COA
• บริการวิเคราะห์สารสำคัญด้วย HPLC ทั้งหมด